牛棒桿菌探針法熒光定量PCR 試劑盒
【產(chǎn)品名稱】牛棒桿菌探針法熒光定量PCR 試劑盒
Name ：Corynebacterium Bovis Probe qPCR Kit
【包裝規(guī)格】50次/盒
【預(yù)期用途】牛棒狀桿菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒狀桿菌屬(Corynebacterium spp.)的某些細(xì)菌引起的膀胱炎和腎盂腎炎。臨床主要特征為頻尿、濁尿、血尿和發(fā)熱。該病主要見于成年母牛，多在妊娠期和產(chǎn)后發(fā)病。本病分布于世界各地。因此快速靈敏檢測(cè)牛棒桿菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)牛棒桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他細(xì)菌的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。
【規(guī)格及成分】
成分 | 包裝 |
2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色蓋） |
熒光PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
牛棒桿菌探針法qPCR 引物混 合液 | 100 μL（白蓋） |
牛棒桿菌qPCR 探針 | 50 μL（棕色管） |
牛棒桿菌探針法qPCR 陽性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
使用手冊(cè) | 1份 |
【運(yùn)輸及保存】低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
【自備試劑】樣品DNA。
【使用方法】一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，**用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA 的制備
7. 如果有 N 個(gè)樣品，**設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 陽性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式細(xì)菌DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 20次免DNA 提取的核酸釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略 了 DNA 提取步驟。
三、、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
成分/每管 | 樣品管 N+2 個(gè) | RT-PCR 陰性對(duì)照 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管 （1-6 管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
牛棒桿菌 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
牛棒桿菌探針法 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板 | 7 μL | - | - |
超純水 | - | 7 μL | - |
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7 號(hào)） | - | - | 各 7 μL（2 號(hào)樣到2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…） |
11.蓋上蓋子后上機(jī)，按面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR：
過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 95℃ | 5 min |
PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 60sec（采集 FAM 通道的熒光信號(hào)） |
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
